| Titre : | Projet ADEKIT : Production et purification de la protéine Chrys8-TEM-1 | | Type de document : | TFE | | Auteurs : | Sonia Farssi, Auteur | | Editeur : | Angleur : HELMo Sainte-Julienne | | Année de publication : | 2020 | | Importance : | 48 p. | | Présentation : | ill. couleur | | Note générale : | TFE (Travail de Fin d'Etudes) -- Bachelier - Technologue de laboratoire médical -- HELMo Sainte-Julienne, Angleur, 2020 | | Langues : | Français (fre) | | Mots-clés : | Amiante TEM-1 Phage Display Genetically Engineered Peptide for Inorganics (GEPI) E. coli BL21DE3 SDS-PAGE Purification par Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) | | Résumé : | Couramment utilisé dans le passé pour ses propriétés (résistance au feu, étanchéité, isolant thermique et électrique, etc.), l’amiante (ou asbeste) est de nos jours interdit de production, commercialisation et d’utilisation en Europe de par les risques qu’il entraine pour notre santé. Etant donné qu’il est toujours présent dans de nombreux bâtiments construits avant son interdiction, la détection d’amiante est devenue impérative. C’est pourquoi le projet ADEKIT a été créé.
Le projet ADEKIT vise la conception d’un kit de détection d’amiante, sur site. Pour ce faire, le laboratoire a utilisé le phage display, une technique biotechnologique inspirée de la biomimétique moléculaire. Cette technologie a permis d’identifier cinq peptides nommés « GEPIs », pour Genetically Engineered Peptide for Inorganics, reconnaissant spécifiquement les 6 types d’amiante. Ces peptides ont, ensuite, été fusionnés à la protéine TEM-1, une enzyme β-lactamase, qui sert de protéine reportrice. En effet, elle dégrade un substrat colorimétrique en un produit, ce qui se traduit par un changement visuel de couleur du milieu.
Ainsi, lorsque le GEPI se lie à de l’amiante, l’enzyme va hydrolyser le substrat UW154-Na qui est jaune en son produit qui est de couleur mauve.
Mon travail a pour but de produire et purifier l’une des protéines exposant le GEPI, Chrys8, il s’agit de la protéine Chrys8-TEM-1 afin d’être exploitée dans le kit ADEKIT.
Avant de procéder à la production de la protéine, le plasmide pET28a-Chrys8-TEM-1 a, d’abord, été amplifié. Un volume de 250µl de plasmides avec une concentration de 123,76 ng/µl a été obtenu. Ainsi, on a donc obtenu 30,94 µg de plasmides. Le plasmide amplifié a été introduit dans Escherichia coli BL21DE3 par transformation bactérienne. Ensuite, la production a pu être réalisée, à partir de clones cultivés, en milieu TB incubé à 18°C après induction par IPTG. Une fois la protéine produite, elle a été purifiée par chromatographie d’affinité sur une colonne chargée de Nickel à l’aide de sa queue poly-histidine (IMAC). Au bout des différentes étapes, un volume de 230 ml de protéines avec une concentration de 3,9207 mg/ml a été obtenu. Pour ce volume, on a donc obtenu 901,761 mg de protéines.
Une fois produite, la protéine sera testée en l’exposant à divers échantillons amiantés et non amiantés, avant d’être utilisée dans le kit ADEKIT. | | Année académique : | 2019-2020 | | Maître de Stage : | Lassaux, Patricia | | Promoteur : | Mahy, Florence | | Etudes : | Technologue de laboratoire médical |
Projet ADEKIT : Production et purification de la protéine Chrys8-TEM-1 [TFE] / Sonia Farssi, Auteur . - Angleur : HELMo Sainte-Julienne, 2020 . - 48 p. : ill. couleur. TFE (Travail de Fin d'Etudes) -- Bachelier - Technologue de laboratoire médical -- HELMo Sainte-Julienne, Angleur, 2020 Langues : Français ( fre) | Mots-clés : | Amiante TEM-1 Phage Display Genetically Engineered Peptide for Inorganics (GEPI) E. coli BL21DE3 SDS-PAGE Purification par Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) | | Résumé : | Couramment utilisé dans le passé pour ses propriétés (résistance au feu, étanchéité, isolant thermique et électrique, etc.), l’amiante (ou asbeste) est de nos jours interdit de production, commercialisation et d’utilisation en Europe de par les risques qu’il entraine pour notre santé. Etant donné qu’il est toujours présent dans de nombreux bâtiments construits avant son interdiction, la détection d’amiante est devenue impérative. C’est pourquoi le projet ADEKIT a été créé.
Le projet ADEKIT vise la conception d’un kit de détection d’amiante, sur site. Pour ce faire, le laboratoire a utilisé le phage display, une technique biotechnologique inspirée de la biomimétique moléculaire. Cette technologie a permis d’identifier cinq peptides nommés « GEPIs », pour Genetically Engineered Peptide for Inorganics, reconnaissant spécifiquement les 6 types d’amiante. Ces peptides ont, ensuite, été fusionnés à la protéine TEM-1, une enzyme β-lactamase, qui sert de protéine reportrice. En effet, elle dégrade un substrat colorimétrique en un produit, ce qui se traduit par un changement visuel de couleur du milieu.
Ainsi, lorsque le GEPI se lie à de l’amiante, l’enzyme va hydrolyser le substrat UW154-Na qui est jaune en son produit qui est de couleur mauve.
Mon travail a pour but de produire et purifier l’une des protéines exposant le GEPI, Chrys8, il s’agit de la protéine Chrys8-TEM-1 afin d’être exploitée dans le kit ADEKIT.
Avant de procéder à la production de la protéine, le plasmide pET28a-Chrys8-TEM-1 a, d’abord, été amplifié. Un volume de 250µl de plasmides avec une concentration de 123,76 ng/µl a été obtenu. Ainsi, on a donc obtenu 30,94 µg de plasmides. Le plasmide amplifié a été introduit dans Escherichia coli BL21DE3 par transformation bactérienne. Ensuite, la production a pu être réalisée, à partir de clones cultivés, en milieu TB incubé à 18°C après induction par IPTG. Une fois la protéine produite, elle a été purifiée par chromatographie d’affinité sur une colonne chargée de Nickel à l’aide de sa queue poly-histidine (IMAC). Au bout des différentes étapes, un volume de 230 ml de protéines avec une concentration de 3,9207 mg/ml a été obtenu. Pour ce volume, on a donc obtenu 901,761 mg de protéines.
Une fois produite, la protéine sera testée en l’exposant à divers échantillons amiantés et non amiantés, avant d’être utilisée dans le kit ADEKIT. | | Année académique : | 2019-2020 | | Maître de Stage : | Lassaux, Patricia | | Promoteur : | Mahy, Florence | | Etudes : | Technologue de laboratoire médical |
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