Titre : | Etude de l'interaction entre deux protéines de l'épissage et les protéines totales chez le Zebrafish | Type de document : | TFE | Auteurs : | Louis Lecrompe, Auteur | Editeur : | Angleur : HELMo Sainte-Julienne | Année de publication : | 2015 | Note générale : | Travail de fin d'études (TFE) -- Bachelier-Technologue de laboratoire médical -- HELMo Sainte-Julienne, Angleur, 2015 | Langues : | Français (fre) | Résumé : | Chez les eucaryotes, toutes les parties d’un fragment d’ARN, provenant de la transcription de l’ADN, ne codent pas pour traduire les protéines. Le processus par lequel l’ARN subit des ablations et des ligatures est appelé épissage. D’abord, un ARN pré-messager est synthétisé à partir de l’ADN. Ensuite, cet ARN, pré-messager est épissé dans le noyau de la cellule pour donner un ARNm de composition différente, dit mature.
Le complexe qui assure l’épissage s’appelle le splicéosome. Il est composé de cinq particules ribonucléoprotéiques, les snRNP, chacune constituée d’un ARN (snRNA) et d’un nombre variable de protéines. Parmi ces protéines, on compte les protéines SR, ainsi nommées car elles contiennent un domaine protéique avec de longues répétitions de sérine et arginine. Ces protéines jouent aussi un rôle dans la stabilisation du génome, la dégradation des ARNm non-sens et la traduction de l’ARNm en protéine.
La première étape consiste à faire une librairie de levures qui expriment un vecteur contenant les ADN complémentaires codant pour les ARNm totaux du poisson. Pour ce faire, nous transformons la souche Y187 avec le vecteur pGADT7 AD contenant les ARNm totaux de poissons. Cette levure contient le gène MEL1 qui code pour une enzyme à activité a-galactosidase sous contrôle du promoteur M1. Le vecteur contient un marqueur de sélection nutritionnel afin de sélectionner les levures transformées. Il contient également une partie du gène GAL4. Les ARNm totaux (cible) sont liés à cette partie de GAL4 (GAL4 AD).
Parallèlement, nous transformons une souche Y2HGold avec le vecteur pGBKT7 contenant les séquences codantes pour les protéines SR. Cette levure contient aussi le gène MEL1. Le vecteur pGBKT7 contient un marqueur de sélection nutritionnel pour sélectionner les levures transformées. Ce dernier contient également l’autre partie du gène GAL4. Les protéines SR d’intérêts (appât) sont liées à cette partie de GAL4 (GAL4 DNA-BD).
Dans un second temps, nous combinons les deux cultures afin de créer des hybrides contenant les deux vecteurs. L’interaction de l’appât et d’une cible permet le rapprochement des deux parties de GAL4 qui devient alors actif. GAL4 a pour effet d’activer le promoteur M1. MEL1 est alors transcrit et il y a production d’une enzyme à activité a-galactosidase qui, en présence d’x-a-gal, produit une coloration bleue. Ces colonies subissent alors une amplification et une purification pour être envoyées au séquençage.
Au terme des quatre doubles hybrides réalisés, nous avons trouvé 7 colonies contenant un ARNm exprimant une protéine qui interagit avec SRSF5b et 10 pour SRSF5a.
Nous devons aussi vérifier certains facteurs dans le but de valider l’efficacité du double hybride :
• La levure contenant la séquence de l’appât est bien capable de la traduire en protéines.
• La protéine SR n’est pas toxique pour la levure et n’active pas le gène GAL4 sans interactions au sein du double hybride.
Les tests réalisés montrent qu’il y a bien production, pas de toxicité et pas d’autoactivation. |
Etude de l'interaction entre deux protéines de l'épissage et les protéines totales chez le Zebrafish [TFE] / Louis Lecrompe, Auteur . - Angleur : HELMo Sainte-Julienne, 2015. Travail de fin d'études (TFE) -- Bachelier-Technologue de laboratoire médical -- HELMo Sainte-Julienne, Angleur, 2015 Langues : Français ( fre) Résumé : | Chez les eucaryotes, toutes les parties d’un fragment d’ARN, provenant de la transcription de l’ADN, ne codent pas pour traduire les protéines. Le processus par lequel l’ARN subit des ablations et des ligatures est appelé épissage. D’abord, un ARN pré-messager est synthétisé à partir de l’ADN. Ensuite, cet ARN, pré-messager est épissé dans le noyau de la cellule pour donner un ARNm de composition différente, dit mature.
Le complexe qui assure l’épissage s’appelle le splicéosome. Il est composé de cinq particules ribonucléoprotéiques, les snRNP, chacune constituée d’un ARN (snRNA) et d’un nombre variable de protéines. Parmi ces protéines, on compte les protéines SR, ainsi nommées car elles contiennent un domaine protéique avec de longues répétitions de sérine et arginine. Ces protéines jouent aussi un rôle dans la stabilisation du génome, la dégradation des ARNm non-sens et la traduction de l’ARNm en protéine.
La première étape consiste à faire une librairie de levures qui expriment un vecteur contenant les ADN complémentaires codant pour les ARNm totaux du poisson. Pour ce faire, nous transformons la souche Y187 avec le vecteur pGADT7 AD contenant les ARNm totaux de poissons. Cette levure contient le gène MEL1 qui code pour une enzyme à activité a-galactosidase sous contrôle du promoteur M1. Le vecteur contient un marqueur de sélection nutritionnel afin de sélectionner les levures transformées. Il contient également une partie du gène GAL4. Les ARNm totaux (cible) sont liés à cette partie de GAL4 (GAL4 AD).
Parallèlement, nous transformons une souche Y2HGold avec le vecteur pGBKT7 contenant les séquences codantes pour les protéines SR. Cette levure contient aussi le gène MEL1. Le vecteur pGBKT7 contient un marqueur de sélection nutritionnel pour sélectionner les levures transformées. Ce dernier contient également l’autre partie du gène GAL4. Les protéines SR d’intérêts (appât) sont liées à cette partie de GAL4 (GAL4 DNA-BD).
Dans un second temps, nous combinons les deux cultures afin de créer des hybrides contenant les deux vecteurs. L’interaction de l’appât et d’une cible permet le rapprochement des deux parties de GAL4 qui devient alors actif. GAL4 a pour effet d’activer le promoteur M1. MEL1 est alors transcrit et il y a production d’une enzyme à activité a-galactosidase qui, en présence d’x-a-gal, produit une coloration bleue. Ces colonies subissent alors une amplification et une purification pour être envoyées au séquençage.
Au terme des quatre doubles hybrides réalisés, nous avons trouvé 7 colonies contenant un ARNm exprimant une protéine qui interagit avec SRSF5b et 10 pour SRSF5a.
Nous devons aussi vérifier certains facteurs dans le but de valider l’efficacité du double hybride :
• La levure contenant la séquence de l’appât est bien capable de la traduire en protéines.
• La protéine SR n’est pas toxique pour la levure et n’active pas le gène GAL4 sans interactions au sein du double hybride.
Les tests réalisés montrent qu’il y a bien production, pas de toxicité et pas d’autoactivation. |
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