Titre : | "Contribution à la validation du dosage de la 1-alpha, 25 dihydroxyvitamine D3 dans le sérum ou le plasma humain à l'aide de la chromatographie liquide à haute performance liée au spectromètre de masse" | Type de document : | TFE | Auteurs : | Maureen Lugand, Auteur | Editeur : | Angleur : HELMo Sainte-Julienne | Année de publication : | 2015 | Note générale : | Travail de fin d'études (TFE) -- Bachelier-Technologue de laboratoire médical -- HELMo Sainte-Julienne, Angleur, 2015 | Langues : | Français (fre) | Résumé : | Objectif : L’objectif général de mon TFE était de développer une méthodologie qui utilise la chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse pour doser la 1,25 (OH)2 Vit D dans le sérum humain. Actuellement la 1,25 (OH)2 Vit D est dosée sur l’automate Isys (IDS : Immuno Diagnostic System) par chimiluminescence. Cependant, l’extraction est longue.
Introduction : La vitamine D existe sous 2 formes : la vitamine D2, appelée ergocalciférol et la vitamine D3 ou cholécalciférol. La vitamine D2 est d’origine végétale et provient de l’irradiation de l’ergostérol obtenu à partir de levure tandis que la vitamine D3, d’origine animale ; est produite par les cellules de l’épiderme à partir du 7-deshydrocholestérol sous l’action des rayons solaires. La vitamine D entre dans la circulation sanguine et se lie à la vitamin D binding protein VDBP. Elle est véhiculée jusqu’au foie. Elle subit une première hydroxylation sur le carbone à la position 25, par la 25-hydroxylase, afin de former la 25 OH Vit. D. Ensuite, le 25 OH Vit D atteint le rein afin d’y être de nouveau hydroxylée et devient la forme active, la 1,25 (OH)2 Vit D. Cela se réalise grâce à la 1-alpha hydroxylase.
Matériel et méthode : Les instruments utilisés étaient un spectromètre de masse Triple Quadripole TQ 5500 d’AB Sciex couplée à une chromatographie liquide UFLC XR Shimadzu. Un standard interne marqué au deutérium ainsi qu’un standard non marqué ont été utilisés pour la partie expérimentale. Une dérivatisation a été réalisée à l’aide du réactif « Ampliflex ». La Multiple Reaction Monitoring (MRM) a été utilisée. Ce mode de scan est utilisé pour la quantification. Seuls les ions d’intérêt sont suivis, ce qui en fait un mode de scan très spécifique et sensible. C’est l’intensité du signal généré par cet ion fragment qui est utilisée pour la quantification de la molécule analysée.
Résultat et discussion : Les résultats obtenus en injectant la 1,25 (Oh)2 Vit D non marquée sont satisfaisants car les pics ont une excellente intensité. Les chromatogrammes indiquent clairement la présence de la 1,25 (OH)2 Vit D dérivatisée qui peut être détectée grâce à deux transactions spécifiques. La 1,25 (OH)2 Vit D marquée de la firme Médical Isotope a été testée et celle-ci nous a donné les résultats non pas de la 1,25 (Oh)2 Vit D marquée mais bien de la 25 OH Vit D. La compagnie a réalisé des tests et s’est rendu compte qu’elle avait dû rencontrer un problème lors de la synthèse du composé. Le composé doit être recommandé dans le but de l’analyser.
Conclusion : Une fois le composé deutéré reçu, il faudra réaliser infusions afin de pouvoir contrôler la reproductibilité et la fiabilité de ce composé. Ensuite, la méthode devra être testée avec des échantillons de patients afin de faire une corrélation entre les résultats obtenus avec la nouvelle méthode de Ab Sciex et les résultats obtenus en routine du dosage de la 1,25 (OH)2 Vit D réalisé à l’aide de la chimiluminescence. Une fois la corrélation réalisée, on analysera les échantillons des patients par la méthode de dérivatisation à l’aide de la chromatographie liée à la spectrométrie de masse. |
"Contribution à la validation du dosage de la 1-alpha, 25 dihydroxyvitamine D3 dans le sérum ou le plasma humain à l'aide de la chromatographie liquide à haute performance liée au spectromètre de masse" [TFE] / Maureen Lugand, Auteur . - Angleur : HELMo Sainte-Julienne, 2015. Travail de fin d'études (TFE) -- Bachelier-Technologue de laboratoire médical -- HELMo Sainte-Julienne, Angleur, 2015 Langues : Français ( fre) Résumé : | Objectif : L’objectif général de mon TFE était de développer une méthodologie qui utilise la chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse pour doser la 1,25 (OH)2 Vit D dans le sérum humain. Actuellement la 1,25 (OH)2 Vit D est dosée sur l’automate Isys (IDS : Immuno Diagnostic System) par chimiluminescence. Cependant, l’extraction est longue.
Introduction : La vitamine D existe sous 2 formes : la vitamine D2, appelée ergocalciférol et la vitamine D3 ou cholécalciférol. La vitamine D2 est d’origine végétale et provient de l’irradiation de l’ergostérol obtenu à partir de levure tandis que la vitamine D3, d’origine animale ; est produite par les cellules de l’épiderme à partir du 7-deshydrocholestérol sous l’action des rayons solaires. La vitamine D entre dans la circulation sanguine et se lie à la vitamin D binding protein VDBP. Elle est véhiculée jusqu’au foie. Elle subit une première hydroxylation sur le carbone à la position 25, par la 25-hydroxylase, afin de former la 25 OH Vit. D. Ensuite, le 25 OH Vit D atteint le rein afin d’y être de nouveau hydroxylée et devient la forme active, la 1,25 (OH)2 Vit D. Cela se réalise grâce à la 1-alpha hydroxylase.
Matériel et méthode : Les instruments utilisés étaient un spectromètre de masse Triple Quadripole TQ 5500 d’AB Sciex couplée à une chromatographie liquide UFLC XR Shimadzu. Un standard interne marqué au deutérium ainsi qu’un standard non marqué ont été utilisés pour la partie expérimentale. Une dérivatisation a été réalisée à l’aide du réactif « Ampliflex ». La Multiple Reaction Monitoring (MRM) a été utilisée. Ce mode de scan est utilisé pour la quantification. Seuls les ions d’intérêt sont suivis, ce qui en fait un mode de scan très spécifique et sensible. C’est l’intensité du signal généré par cet ion fragment qui est utilisée pour la quantification de la molécule analysée.
Résultat et discussion : Les résultats obtenus en injectant la 1,25 (Oh)2 Vit D non marquée sont satisfaisants car les pics ont une excellente intensité. Les chromatogrammes indiquent clairement la présence de la 1,25 (OH)2 Vit D dérivatisée qui peut être détectée grâce à deux transactions spécifiques. La 1,25 (OH)2 Vit D marquée de la firme Médical Isotope a été testée et celle-ci nous a donné les résultats non pas de la 1,25 (Oh)2 Vit D marquée mais bien de la 25 OH Vit D. La compagnie a réalisé des tests et s’est rendu compte qu’elle avait dû rencontrer un problème lors de la synthèse du composé. Le composé doit être recommandé dans le but de l’analyser.
Conclusion : Une fois le composé deutéré reçu, il faudra réaliser infusions afin de pouvoir contrôler la reproductibilité et la fiabilité de ce composé. Ensuite, la méthode devra être testée avec des échantillons de patients afin de faire une corrélation entre les résultats obtenus avec la nouvelle méthode de Ab Sciex et les résultats obtenus en routine du dosage de la 1,25 (OH)2 Vit D réalisé à l’aide de la chimiluminescence. Une fois la corrélation réalisée, on analysera les échantillons des patients par la méthode de dérivatisation à l’aide de la chromatographie liée à la spectrométrie de masse. |
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