| Titre : | Mise au point d'une technique d'isolement de lymphocytes T CD4+ aviaires par billes magnétiques dans un modèle de lymphome viro-induit | | Type de document : | TFE | | Auteurs : | Grégory Borlée, Auteur | | Editeur : | Angleur : HELMo Sainte-Julienne | | Année de publication : | 2015 | | Note générale : | Travail de fin d'études (TFE) -- Bachelier-Technologue de laboratoire médical -- HELMo Sainte-Julienne, Angleur, 2015 | | Langues : | Français (fre) | | Résumé : | Le virus de la maladie de Marek (MDV), le Gallid Herpesvirus 2 (GaHV-2) est un herpesvirus aviaire responsable de lymphomes T chez le poulet. Malgré une vaccination efficace de nos jours mais sujette à controverse dans le passé, cet agent pathogène peut provoquer d’énormes pertes financières lorsqu’il touche des élevages grâce à sa grande résistance dans l’environnement. Avant de provoquer des tumeurs, le virus passe par une phase de latence, où son génome persiste dans la cellule hôte mais sans aucune production de protéine structurale.
Le sujet de mon travail de fin d’étude était basé sur l’étude de cette étape du cycle viral de GaHV-2. J’ai aidé à mettre au point un protocole d’isolement des lymphocytes CD4+, principales cibles du virus durant la latence, par une technique utilisant des billes magnétiques. La première partie de la manipulation consistait à isoler les lymphocytes périphériques du sang prélevé sur des poules par un traitement au Ficoll.
D’autres types d’échantillons ont été utilisés comme le sang complet ainsi que divers mélanges de MSB-1 (lignée cellulaire de T CD4+ obtenus in vitro à partir de lymphomes induits par une souche de GaHV-2) et DT-40 (lignée cellulaire de lymphocytes B obtenus in vitro à partir de lymphomes B induits par le virus Rous-associated virus 1). Ensuite, on procède au couplage d’anticorps de souris anti poule CD4+ et d’anticorps de chèvre anti souris présents sur la surface de billes magnétiques. L’étape suivante résidait à mettre en contact les billes magnétiques contenant l’anticorps de souris anti poule CD4+ avec l’échantillon afin que l’antigène de surface CD4+ des cellules lymphocytaires CD4+ se lie aux billes magnétiques. Enfin le complexe bille-anticorps-antigène-cellule T CD4+ est attiré à l’aide d’un aimant permanent et le surnageant est jeté.
Pour améliorer le pourcentage de cellules capturées par les billes, diverses conditions ont été testées comme la température et la durée d’incubation ainsi que le système de rotation. Les quantités d’anticorps et de billes magnétiques ont aussi été expérimentées, de même que certains aspects pratiques.
Ce protocole servira pour une expérience in vivo consistant à isoler l’ADN et l’ARN des lymphocytes T CD4+ de poulets infectés artificiellement par le GaHV-2 afin d’effectuer des études sur la transcription des gènes durant la phase de latence. |
Mise au point d'une technique d'isolement de lymphocytes T CD4+ aviaires par billes magnétiques dans un modèle de lymphome viro-induit [TFE] / Grégory Borlée, Auteur . - Angleur : HELMo Sainte-Julienne, 2015. Travail de fin d'études (TFE) -- Bachelier-Technologue de laboratoire médical -- HELMo Sainte-Julienne, Angleur, 2015 Langues : Français ( fre) | Résumé : | Le virus de la maladie de Marek (MDV), le Gallid Herpesvirus 2 (GaHV-2) est un herpesvirus aviaire responsable de lymphomes T chez le poulet. Malgré une vaccination efficace de nos jours mais sujette à controverse dans le passé, cet agent pathogène peut provoquer d’énormes pertes financières lorsqu’il touche des élevages grâce à sa grande résistance dans l’environnement. Avant de provoquer des tumeurs, le virus passe par une phase de latence, où son génome persiste dans la cellule hôte mais sans aucune production de protéine structurale.
Le sujet de mon travail de fin d’étude était basé sur l’étude de cette étape du cycle viral de GaHV-2. J’ai aidé à mettre au point un protocole d’isolement des lymphocytes CD4+, principales cibles du virus durant la latence, par une technique utilisant des billes magnétiques. La première partie de la manipulation consistait à isoler les lymphocytes périphériques du sang prélevé sur des poules par un traitement au Ficoll.
D’autres types d’échantillons ont été utilisés comme le sang complet ainsi que divers mélanges de MSB-1 (lignée cellulaire de T CD4+ obtenus in vitro à partir de lymphomes induits par une souche de GaHV-2) et DT-40 (lignée cellulaire de lymphocytes B obtenus in vitro à partir de lymphomes B induits par le virus Rous-associated virus 1). Ensuite, on procède au couplage d’anticorps de souris anti poule CD4+ et d’anticorps de chèvre anti souris présents sur la surface de billes magnétiques. L’étape suivante résidait à mettre en contact les billes magnétiques contenant l’anticorps de souris anti poule CD4+ avec l’échantillon afin que l’antigène de surface CD4+ des cellules lymphocytaires CD4+ se lie aux billes magnétiques. Enfin le complexe bille-anticorps-antigène-cellule T CD4+ est attiré à l’aide d’un aimant permanent et le surnageant est jeté.
Pour améliorer le pourcentage de cellules capturées par les billes, diverses conditions ont été testées comme la température et la durée d’incubation ainsi que le système de rotation. Les quantités d’anticorps et de billes magnétiques ont aussi été expérimentées, de même que certains aspects pratiques.
Ce protocole servira pour une expérience in vivo consistant à isoler l’ADN et l’ARN des lymphocytes T CD4+ de poulets infectés artificiellement par le GaHV-2 afin d’effectuer des études sur la transcription des gènes durant la phase de latence. |
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